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乳與乳制品中需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定

發布時間:2023-07-21      瀏覽次數:4073    分享:

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      需氧芽孢總數測定1
      嗜熱需氧芽孢總數測定2

農業標準NY/T1331-2007標準中的定義:

NY/T1331-2007

需氧芽孢總數 total aerobic bacterial spores 指在有氧條件下,經80℃加熱處理10min,能存活并且于36℃下培養48h在MPC瓊脂平板上形成可計數的菌落總數。

嗜熱需氧芽孢 thermophilic aerobic bacterial spores 指在有氧條件下,經100℃加熱處理30min,能存活并且于55℃下培養48h在DTA平板上形成可計數菌落的微生物。

芽孢菌污染是現代乳制品生產加工過程中的污染之一。

原料乳、消毒奶、煉乳、奶粉中,均不同程度的耐熱需氧和厭氧芽孢桿菌污染,如果這些耐熱菌在奶制品中達到一定濃度,必然引起奶制品變質,它們會導致乳與乳制品品質下降、風味改變、保質期縮短及加工過程異常等,甚至危害人體健康。

01 污染源 :① 乳的良好營養適宜微生物生長。據報道,芽孢桿菌屬在原料乳中污染最嚴重。芽孢是某些細菌在生長發育后期,在細胞內形成一個圓形或橢圓形的抗逆性休眠體。② 農場中的飼料、±壤和糞便等易受芽孢菌污染,牛舍周圍也廣泛存在芽孢菌,這些菌易污染奶牛乳頭表面,使原料乳污染芽孢菌。

02 影響 :這些耐熱菌在奶制品中達到一定濃度,必然引起奶制品變質,它們會導致乳與乳制品品質下降、風味改變、保質期縮短及加工過程異常等,甚至危害人體健康。

03 檢測原理:將樣品加熱處理以除去非芽孢菌,然后向樣液中加入能為芽孢菌提供豐富營養的乳平板計數瓊脂培養基,放入合適環境下培養,最后計數。

需氧芽孢總數測定

一、標準依據農業標準NY/T1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定》中第二部分:需氧芽孢總數測定。

二、原理取一定量的液體檢樣或檢樣的初級稀釋液,將其在80℃下加熱10min,在MPC瓊脂培養基內,于36℃條件下培養48 h,菌落計數,算出每毫升(克)檢樣中的需氧芽孢總數。

三、檢測程序

需氧芽孢總數檢驗程序

四、接種及培養

1 檢樣處理

1.1 以無菌操作打開待檢樣品包裝容器,液體樣品應避免形成泡沫。

1.2 以無菌操作稱取固體或半固體檢樣10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)預熱至45℃的滅菌稀釋液(蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液)的三角燒瓶中(瓶內預置適當數量的玻璃珠),經充分振搖(必要時用均質器均質或無菌乳缽研磨)制成10-1初級稀釋液。

2 加熱處理

2.1 用無菌吸管吸取液體檢樣、固體或半固體檢樣的初級稀釋液5mL~10mL于無菌試管中,注意不應使樣液接觸到超出水面和位于水面下2cm以內的試管內壁。

2.2 立即將上述試管放人80℃±1℃的水浴中,使試管內液面至少低于水面4cm。

2.3 加熱處理10min±1min。在對照管中放一支溫度計測定溫度。試管內樣液的升溫時間不應超過5min。

2.4 將加熱處理后的試管取出立即放到20℃以下的流水中冷卻。

3 進一步稀釋液的制備

用一支1mL無菌吸管,吸取1mL經加熱處理的樣液,于含有9mL無菌稀釋液的試管中,振搖試管,混合均勻,,獲得其10倍稀釋液(液體檢樣10-1稀釋液或固體檢樣10-2稀釋液)。按上述操作方法,做10倍遞增稀釋,如此每遞增稀釋一次,換用一支1mL無菌吸管。

4 接種和培養

4.1 根據對樣品中芽孢含量的估計,選擇適宜的稀釋度,即通過正確地選擇,使得在培養結束后至少有一個培養皿里長出10個~150個菌落。分別在做10倍遞增稀釋的同時,即以吸取該稀釋度的吸管移1mL該稀釋液于無菌培養皿內,每個稀釋度接種兩個培養皿。

4.2 立即傾注12mL~15mL已融化并冷卻至45℃±1℃的MPC瓊脂培養基到每個培養皿中。

4.3 小心地轉動培養皿使接種樣液和培養基混合均勻,水平放置使混合物凝固。從熱處理結束到接種樣液和培養基混合所用的時間不得超過15min。

4.4 接種樣液的同時,用1mL稀釋液,作空白試驗。

4.5 待瓊脂凝固后,堆疊培養皿,倒置在培養箱中,于36℃±1℃培養48h±2h。

注:為了避免菌落蔓延使得無法計數,可采取以下措施:
      ① 待培養皿里的混合物凝固后,于其上再鋪一層(約5mL)還保持液體狀態的該培養基;
      ② 待培養皿里的混合物凝固后,翻轉培養皿,于培養皿的蓋子里放一片濾紙并在濾紙上漓幾滴甘油。

五、菌落計數 

1 做平板菌落計數時,可用肉眼觀察,需要時用放大鏡檢查。

2 蔓延的菌落被認為是單一菌落。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分不到平板面積的1/4,計數未受影響的平板部分的菌落并計算出整個平板的相對量。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分超過了平板面積的1/4,不應計數。

六、結果計算 

1 保留含有10個~150個菌落的培養皿。

用公式(2)計算每毫升或每克樣品中需氧芽孢總數:

需氧芽孢總數計算公式

2 如果所有稀釋度培養皿中菌落數均少于10個,結果報告為“樣品中需氧芽孢總數小于10×1/d CFU/mL(g)”,式中d為最低稀釋液的稀釋度。

3 如果所有稀釋度培養皿中的菌落數均多于150個,結果報告為“樣品中需氧芽孢總數大于150×1/d CFU/mL(g)" ,式中d為最高稀釋液的稀釋度。

嗜熱需氧芽孢總數測定

一、標準依據農業標準NY/T1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定》中第三部分:嗜熱需氧芽孢總數測定。

二、原理取一定量的液體檢樣或檢樣的初級稀釋液,,將其在100℃下加熱30min,在DTA培養基內,于55℃條件下培養48h,菌落計數,算出每毫升(克)檢樣中的嗜熱需氧芽孢數。

三、檢測程序

嗜熱需氧芽孢總數檢驗程序

四、接種及培養

1 檢樣處理

1.1 以無菌操作打開待檢樣品包裝容器,液體樣品應避免形成泡沫。

1.2 以無菌操作稱取固體或半固體檢樣10g(或25g)于含有90mL(或225 mL)預熱至45℃的滅菌稀釋液(蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液)的三角燒瓶中(瓶內預置適當數量的玻璃珠) ,經充分振搖(必要時用均質器均質或無菌乳缽研磨)制成10-1初級稀釋液。

2 加熱處理

2.1 用無菌吸管吸取液體檢樣、固體或半固體檢樣的初級稀釋液5mL~ 10mL于無菌試管中,注意不應使樣液接觸到超出水面和位于水面下2cm以內的試管內壁。

2.2 立即將上述試管放入100℃的水浴中,使試管內液面至少低于水面4 cm。

2.3 加熱處理30min±1min,從試管放人100℃水浴中開始計時。

2.4 將加熱處理后的試管取出立即放到20℃以下的流水中冷卻。

3 進一步稀釋液的制備

如果有必要,取一支1mL無菌吸管,吸取1mL經加熱處理的樣液于含有9mL無菌稀釋液的試管中,振搖試管,混合均勻,獲得其10倍稀釋液(液體檢樣10-1稀釋液或固體檢樣10-2稀釋液)。

4 接種和培養

4.1 根據對樣品中嗜熱需氧芽孢含量的估計,選擇適宜的稀釋度,即通過正確地選擇,使得在培養結束后至少有一個培養皿里長出10個~150個菌落。分別在做10倍遞增稀釋的同時,即以吸取該稀釋度的吸管移1mL該稀釋液于無菌培養皿內,每個稀釋度接種兩個培養皿。

注:在每毫升(克)乳或乳制品中,常常只有少量的嗜熱需氧芽孢。如果想測出它們的數量,可以采取以下措施:
      ① 在多個培養皿里接種足夠量的經加熱處理的液體樣品或經加熱處理的初級稀釋液;
      ② 使用更大的培養皿,以能夠在其中接種多于1mL經加熱處理的液體樣品或經加熱處理的初級稀釋液。
在報告結果時,必須要注明對檢測方法進行的調整。

4.2 立即傾注12mL~15mL已融化并冷卻至45℃±1℃的DTA培養基到每個培養皿中。

4.3 小心地轉動培養皿使接種樣液和培養基混合均勻,水平放置使混合物凝固。從熱處理結束到接種樣液和培養基混合所用的時間不得超過15min。

4.4 接種樣液的同時,用1mL稀釋液作空白試驗。

4.5 待瓊脂凝固后,堆疊培養皿,把其倒置在塑料袋里,然后將其放人培養箱中,于55℃±1℃培養48h±2h。

注:為了避免菌落蔓延使得無法計數,可采取以下措施:
      ① 待培養皿里的混合物凝固后,于其上再鋪一層(約5mL)還保持液體狀態的該培養基;
      ② 待培養皿里的混合物凝固后,翻轉培養皿,于培養皿的蓋子里放一片濾紙并在濾紙上滴幾滴甘油。

五、菌落計數 

1 做平板菌落計數時,可用肉眼觀察,需要時用放大鏡檢查。

2 蔓延的菌落被認為是單一菌落。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分不到平板面積的1/4,計數未受影響的平板部分的菌落并計算出整個平板的相對量。如果被蔓延菌落所覆蓋的部分超過了平板面積的1/4,不應計數。

六、結果計算 

1 保留含有10個~150個菌落的培養皿。

用公式(3)計算每毫升或每克樣品中嗜熱需氧芽孢總數:

嗜熱需氧芽孢總數計算公式

2 如果所有稀釋度培養皿中菌落數均少于10個,結果報告為“樣品中嗜熱需氧芽孢總數小于10×1/d CFU/mL(g)”,式中d為最低稀釋液的稀釋度。

3 如果所有稀釋度培養皿中的菌落數均多于150個,結果報告為“樣品中嗜熱需氧芽孢總數大于150×1/d CFU/mL(g)" ,式中d為最高稀釋液的稀釋度。

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