微生物學檢測那些事之菌落總數
發布時間：2024-01-24 瀏覽次數：799
菌落總數又稱需氧菌總數、嗜氧菌總數，在英文標準中的術語有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count，Colonies number等，是微生物學檢測技術中應用最廣泛的一種衛生學檢測技術，亦是嗜溫細菌和真菌的菌落總計數，其通過一定條件下如需氧情況、營養條件、pH、培養溫度和時間等，每單位（如克、毫升等）檢樣所生長出來的微生物，在衛生學上可以表示被污染程度的標志。
常見操作方法
菌落計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法（Most-Probable-Number Method，簡稱MPN法），其中平皿法可分為傾注平皿法和涂布平皿法，常見的菌落總數操作方法見表1。
表1 常見菌落總數的操作方法匯總
| 測試標準 | 適用范圍 | 操作方法 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》 | 食品 | 傾注平皿法/菌落總數測試片 |
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 食品 | 傾注平皿法/螺旋板法 |
| GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》 | 飼料 | 傾注平皿法 |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》 | 游泳池水 | 傾注平皿法 |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》 | 飲用水/水源水 | 傾注平皿法/酶底物法 |
| WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》 | 環境 | 六級篩孔撞擊式微生物采樣器 |
| GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準 附錄B2》 | 一次性衛生用品 | 傾注平皿法 |
| 《化妝品安全技術規范》2015版 | 化妝品 | 傾注平皿法 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 化妝品 | 平皿法/膜過濾法 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 藥品 | 平皿法/薄膜過濾法/MPN法 |
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | ||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | ||
| ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查：微生物限度計數》 |
根據上表的適用范圍和操作方法可得出，平皿法是使用范圍最廣。
根據測試標準適用范圍和樣品特性：
A. 平皿法因可操作性性強，會更多用于污染度高的被檢樣品；
B. 薄膜過濾法適用于測試量需求大且污染度一般的液體樣品；
C. MPN法可用于微生物計數時精確度較差時，包括對于某些微生物污染度很小的樣品。
故在日常測試中，可根據樣品的污染度情況去選擇更合適的菌落總數測試操作方法。
樣品的取樣量與稀釋液選擇
樣品的取樣量與其質量標準或測試方法去選擇，對于官方標準未明確取樣量的，亦可根據結果的代表性加大取樣量。稀釋緩沖液的選擇則是要求樣品在稀釋緩沖液中能夠充分混合，從而保證樣品的均一性，故不同樣品，會有不同的稀釋液需求。日常工作中，常見的稀釋緩沖液與要求見表2。
表2 常見的稀釋緩沖液信息匯總
| 測試標準 | 樣品量 | 稀釋液 | 備注 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》 | 25g/mL | 無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 | |
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 50g/mL | 磷酸鹽緩沖液/無菌水 | |
| GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》 | 25g/10g | 0.85%生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 | |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》 | 原液 | 無菌生理鹽水 | |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》 | 原液 | 無菌生理鹽水 | |
| WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》 | 28.3L/min，（5-15）min | 不適用 | |
| GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準 附錄B2》 | 10±1g | 無菌生理鹽水（200mL） | 不進行梯度稀釋，做5平行 |
| 《化妝品安全技術規范》2015版 | 10g/mL | 無菌生理鹽水 | 無法充分溶解稀釋液中的樣品可加吐溫80和/或石蠟 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 1:10（樣品：加稀釋液后） | 無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等 | 最終的取樣量與稀釋液，需通過樣品方法學適用性驗證方能使用。 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | |||
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查：微生物限度計數》 |
常見培養條件
菌落總數的培養條件會因不同的樣品類型或制定機構而有所差異，其差異包括培養基、培養溫度和培養時間的選擇。菌落總數常見的培養條件見表3。
表3 菌落總數的常見培養條件匯總
| 測試標準 | 培養基 | 培養溫度 | 培養時間 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》 | 平板計數瓊脂（PCA） | 36±1℃（水產品30±1℃） | 48±2h（水產品72±3h） |
| FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 35±1℃（牛奶32±1℃） | 48±2h | |
| GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》 | 營養瓊脂（NA） | 30±1℃ | 72±3h |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》 | 36±1℃ | 48h | |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》 | 36±1℃ | 48±2h | |
| WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》 | 35~37℃ | 48h | |
| GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準 附錄B2》 | 35±2℃ | 48h后 | |
| 《化妝品安全技術規范》2015版 | 卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂 （LTNA） | 36±1℃ | 48±2h |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA） | 32.5±2.5℃ | 72±6h |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 3~5天 | ||
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查：微生物限度計數》 |
結果觀察與報告
菌落總數在進行計數時，肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（CFU/cfu，Colony Forming Units）進行報告。在計數時，首先需明確計數范圍是否符合要求，從而保證測試結果的準確性和可靠性，不同的測試方法在首選計數范圍會有一定差異，以及顯色劑在觀察中的應用也有一定的要求。詳情見表4。
表4 結果觀察與報告的一般要求
| 測試標準 | 培養基中是否可加顯色劑1 | 首選計數范圍 | 最終結果報告 |
| GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》 | 是 | 30~300cfu | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字，＞300cfu的則報告TNTC2，采用“四舍五入”。 |
| FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 | 否 | 25~250cfu | ＜25cfu則報告＜25或實際值，＞250cfu則報告＞250或TNTC2。 |
| GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》 | 否 | 30~300cfu | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》 | 否 | 無 | 報告cfu/m3 |
| GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準 附錄B2》 | 否 | 無 | 全部無生長報＜4cfu/g（mL），若生長，報100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字。 |
| 《化妝品安全技術規范》2015版 | 是 | 30~300cfu | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字，＞300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 | 否 | 平皿法：30~300cfu；薄膜過濾法：15~150cfu。 | 100cfu以內報整數，超過100cfu兩位有效數字。 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 | 否 | 平皿法：不超過250cfu；薄膜過濾法：記錄結果。 | 取兩位有效數字報告 |
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 | |||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 | |||
| ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查：微生物限度計數》 | 否 | 平皿法：不超過300cfu；薄膜過濾法：不超過100cfu | 取兩位有效數字報告 |
| 注： 1. 顯色劑一般為TTC，TTC全稱為0.5%氯化三苯四氮唑。加此顯示劑后，多數菌落顯示紅色。 2. TNTC全稱為多不可數，即Too Number To Count。 | |||
菌落總數的測定，不同樣品有不同的特性，故在進行此方面衛生學測試時，結合行業需求，以及樣品的生產工藝、消費對象、使用方式等需求，選擇合適的測試操作流程，同時保證在報告結果時，亦需根據市場所選用的方法進行報告結果。
綜合以上，衛生學的菌落測試在實驗操作中雖然有差異，但總體的差異性不大，比如培養基都是非選擇性生長培養基，培養溫度基本在35℃左右，培養時間則溫度越高，時間則可減少。故保證菌落總數測試結果的準確性與可靠性時，根據實際需求，通過調節測試方法的取樣、稀釋液、培養條件等來建立更符合本實驗室的菌落總數測試方法。
參考文獻
1、GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》
2、FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》
3、GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》
4、GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》
5、GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》
6、WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》
7、GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準 附錄B2》
8、《化妝品安全技術規范》2015版
9、BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》
10、USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》
11、BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
12、EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
13、《無菌產品微生物限度檢查：微生物限度計數》通則1105 中國藥典 2020版
來源：實驗媽媽，作者：韓健，文章版權歸原作者所有；
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