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微生物學檢測那些事之菌落總數

發布時間:2024-01-24    瀏覽次數:353

菌落總數又稱需氧菌總數、嗜氧菌總數,在英文標準中的術語有Total plate count, Standard plate-count bacteria, Aerobic bacterial count,Colonies number等,是微生物學檢測技術中應用最廣泛的一種衛生學檢測技術,亦是嗜溫細菌和真菌的菌落總計數,其通過一定條件下如需氧情況、營養條件、pH、培養溫度和時間等,每單位(如克、毫升等)檢樣所生長出來的微生物,在衛生學上可以表示被污染程度的標志。

常見操作方法

菌落計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法(Most-Probable-Number Method,簡稱MPN法),其中平皿法可分為傾注平皿法和涂布平皿法,常見的菌落總數操作方法見表1。

表1 常見菌落總數的操作方法匯總

測試標準適用范圍操作方法
GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》食品傾注平皿法/菌落總數測試片
FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》食品傾注平皿法/螺旋板法
GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定飼料傾注平皿法
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》游泳池水傾注平皿法
GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》飲用水/水源水傾注平皿法/酶底物法
WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》環境六級篩孔撞擊式微生物采樣器
GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準  附錄B2》一次性衛生用品傾注平皿法
《化妝品安全技術規范》2015版化妝品傾注平皿法
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》化妝品平皿法/膜過濾法
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》藥品平皿法/薄膜過濾法/MPN法
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查:微生物限度計數》

根據上表的適用范圍和操作方法可得出,平皿法是使用范圍最廣。

根據測試標準適用范圍和樣品特性:
A. 平皿法因可操作性性強,會更多用于污染度高的被檢樣品;
B. 薄膜過濾法適用于測試量需求大且污染度一般的液體樣品;
C. MPN法可用于微生物計數時精確度較差時,包括對于某些微生物污染度很小的樣品。

故在日常測試中,可根據樣品的污染度情況去選擇更合適的菌落總數測試操作方法。

樣品的取樣量與稀釋液選擇

樣品的取樣量與其質量標準或測試方法去選擇,對于官方標準未明確取樣量的,亦可根據結果的代表性加大取樣量。稀釋緩沖液的選擇則是要求樣品在稀釋緩沖液中能夠充分混合,從而保證樣品的均一性,故不同樣品,會有不同的稀釋液需求。日常工作中,常見的稀釋緩沖液與要求見表2。

表2 常見的稀釋緩沖液信息匯總

測試標準樣品量稀釋液備注
GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》25g/mL無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 
FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》50g/mL磷酸鹽緩沖液/無菌水 
GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定25g/10g0.85%生理鹽水/磷酸鹽緩沖液 
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》原液無菌生理鹽水 
GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》原液無菌生理鹽水 
WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》28.3L/min,(5-15)min不適用 
GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準  附錄B2》10±1g無菌生理鹽水(200mL)不進行梯度稀釋,做5平行
《化妝品安全技術規范》2015版10g/mL無菌生理鹽水無法充分溶解稀釋液中的樣品可加吐溫80和/或石蠟
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》1:10(樣品:加稀釋液后)無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等最終的取樣量與稀釋液,需通過樣品方法學適用性驗證方能使用。
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP  9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查:微生物限度計數》

常見培養條件

菌落總數的培養條件會因不同的樣品類型或制定機構而有所差異,其差異包括培養基、培養溫度和培養時間的選擇。菌落總數常見的培養條件見表3。

表3 菌落總數的常見培養條件匯總

測試標準培養基培養溫度培養時間
GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》平板計數瓊脂(PCA)36±1℃(水產品30±1℃)48±2h(水產品72±3h)
FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》35±1℃(牛奶32±1℃)48±2h
GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定營養瓊脂(NA)30±1℃72±3h
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》36±1℃48h
GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》36±1℃48±2h
WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》35~37℃48h
GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準  附錄B2》35±2℃48h后
《化妝品安全技術規范》2015版卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂 (LTNA)36±1℃48±2h
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)32.5±2.5℃72±6h
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》3~5天
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查:微生物限度計數》

結果觀察與報告

菌落總數在進行計數時,肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(CFU/cfu,Colony Forming Units)進行報告。在計數時,首先需明確計數范圍是否符合要求,從而保證測試結果的準確性和可靠性,不同的測試方法在首選計數范圍會有一定差異,以及顯色劑在觀察中的應用也有一定的要求。詳情見表4。

表4  結果觀察與報告的一般要求

測試標準培養基中是否可加顯色劑1首選計數范圍最終結果報告
GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》30~300cfu100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字,>300cfu的則報告TNTC2,采用“四舍五入”。
FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》25~250cfu<25cfu則報告<25或實際值,>250cfu則報告>250或TNTC2。
GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定30~300cfu100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字,>300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》30~300cfu100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字,>300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。
GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法  微生物指標》30~300cfu100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字,>300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。
WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》報告cfu/m3
GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準  附錄B2》全部無生長報<4cfu/g(mL),若生長,報100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字。
《化妝品安全技術規范》2015版30~300cfu100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字,>300cfu的則報告TNTC2。采用“四舍五入”。
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》平皿法:30~300cfu;薄膜過濾法:15~150cfu。100cfu以內報整數,超過100cfu兩位有效數字。
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》平皿法:不超過250cfu;薄膜過濾法:記錄結果。取兩位有效數字報告
BP Appendix XVI B  《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
ChP1105 2020版《非無菌產品微生物限度檢查:微生物限度計數》平皿法:不超過300cfu;薄膜過濾法:不超過100cfu取兩位有效數字報告
注:  
1. 顯色劑一般為TTC,TTC全稱為0.5%氯化三苯四氮唑。加此顯示劑后,多數菌落顯示紅色。  
2. TNTC全稱為多不可數,即Too Number To Count。   

菌落總數的測定,不同樣品有不同的特性,故在進行此方面衛生學測試時,結合行業需求,以及樣品的生產工藝、消費對象、使用方式等需求,選擇合適的測試操作流程,同時保證在報告結果時,亦需根據市場所選用的方法進行報告結果。

綜合以上,衛生學的菌落測試在實驗操作中雖然有差異,但總體的差異性不大,比如培養基都是非選擇性生長培養基,培養溫度基本在35℃左右,培養時間則溫度越高,時間則可減少。故保證菌落總數測試結果的準確性與可靠性時,根據實際需求,通過調節測試方法的取樣、稀釋液、培養條件等來建立更符合本實驗室的菌落總數測試方法。

參考文獻

1、GB4789.2-2022 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》
2、FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》
3、GB/T13093-2006 《飼料中細菌總數的測定》
4、GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物檢驗方法 細菌總數測定》
5、GB/T5750.12—2023《生化飲用水標準檢驗方法 微生物指標》
6、WS 394-2012 《公共場所集中空調通風系統衛生規范 附錄D 集中空調送風中細菌總數檢驗方法》
7、GB15979-2002 《一次性使用衛生用品衛生標準  附錄B2》
8、《化妝品安全技術規范》2015版
9、BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》
10、USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》
11、BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》
12、EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》
13、《無菌產品微生物限度檢查:微生物限度計數》通則1105 中國藥典 2020版

來源:實驗媽媽,作者:韓健,文章版權歸原作者所有;
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